Leveduras vivas e cultivo de leveduras em dietas de bovinos leiteiros - Parte I

Texto: José Eduardo P. Santos, Leandro F. Greco

Foto: Cortesia da Lallemand, Animal Nutrition

De maneira geral, a adição de levedura viva ou cultura de levedura nas dietas aumenta a produção de leite, a concentração de gordura no leite, estabiliza o pH ruminal e melhora a digestão de fibra no rúmen. Em animais jovens, a adição de leveduras é capaz de alterar a flora microbiana intestinal e reduzir a incidência de diarreias, podendo ainda aumentar a ingestão de concentrados e o ganho de peso.

Artigo cedido pela comissão organizadora do II Formuleite

Introdução

Leveduras são organismos eucariotos unicelulares do reino dos fungos que fermentam carboidratos e se reproduzem por brotamento ou esporulação. A levedura mais comumente utilizada em nutrição de ruminantes é a Saccharomyces cerevisiae. Ela secreta enzimas capazes de converter compostos orgânicos complexos em outros mais simples. De maneira geral, os produtos comerciais que contêm leveduras são compostos de leveduras vivas ou então misturas em distintas proporções de leveduras vivas e mortas na presença do meio de cultivo, o que é mais conhecido como cultura de leveduras.

De maneira geral, o efeito das leveduras vivas e cultura de leveduras se dá por alterações no ambiente ruminal, como mudanças na população microbiana, que favorecem o crescimento de microrganismos celulolíticos e daqueles utilizadores do ácido lático. Apesar de alguns efeitos do uso de aditivos a base de leveduras estarem relativamente bem caracterizados, não é claro o (s) mecanismo (s) exato (s) pelo qual (is) a sua adição à dieta de bovinos melhora o desempenho animal. De maneira geral, a adição de levedura viva ou cultura de levedura aumenta a produção de leite, aumenta a concentração de gordura no leite, estabiliza o pH ruminal, melhora a digestão de fibra no rúmen, resulta em aumento negligível na ingestão de matéria seca e tem pequeno impacto no fluxo de proteína microbiana para o duodeno. Em animais jovens, a adição de leveduras é capaz de alterar a flora microbiana intestinal e reduzir a incidência de diarreias. Em casos esporádicos, a ingestão de concentrados e o ganho de peso em bezerros são melhorados com o uso de leveduras.

Leveduras com atividade ruminal

Produtos comerciais contendo leveduras, utilizados nas dietas de ruminantes, são compostos de uma mistura de céluas vivas e mortas na presença do meio de cultivo, o qual é rico em açúcares e outros carboidratos, aminoácidos e peptídeos, ácidos orgânicos e oligossacarídeos presentes na parede celular. Os produtos baseados em apenas células vivas são vendidos como leveduras vivas, e aqueles com presença de células vivas e mortas mais o substrato utilizado para o cultivo das leveduras são vendidos com cultura de leveduras. Nos EUA, os aditivos alimentares a base de leveduras são reconhecidos como seguros para alimentação animal e recebem a denominação GRAS, da sigla inglesa “Generally Recognized as Safe” pelo orgão responsável por segurança em aditivos alimentares na área de saúde alimentar e nutrição aplicada do “FDA”, a agência responsável pela parte regulatória do ministério da saúde americano.

De maneira geral, produtos a base de leveduras são denominados probióticos e prebióticos. Os probióticos são produtos contendo microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do animal. Já os prebióticos são produtos contendo carboidratos não-digeríveis benéficos ao animal por estimularem seletivamente populações bacterinanas desejáveis no trato digestivo e favorecerem a saúde animal.

Mecanismos de ação ruminal

A literatura sobre o mecanismo de ação das leveduras como aditivos alimentares para bovinos não é clara, e inúmeros são os meios de ação propostos para explicar os efeitos dos produtos a base de levedura no desempenho de bovinos, sendo que os principais deles se dão pela modificação do ambiente ruminal. De maneira geral, há um aumento na população  bacteriana do rúmen com a suplementação a base de S. cerevisiae, sendo que a resposta parece ser dependente da cepa de Saccharomyces utilizada. Esse aumento na população bacteriana no rúmen é seguido também por um aumento nas populações de bactérias celulolíticas e aquelas consumidoras de ácido lático. Em alguns casos, observa-se também um aumento no número de protozoários no líquido ruminal com a suplementação com S. cerevisiae.

Modulação do pH ruminal

Inúmeros estudos demonstraram que S. cerevisiae estimula o crescimento de bactérias utilizadoras de ácido lático, principalmente a Selenomonas ruminantium e a Megasphera elsdenii. Ao contrário do que alguns acreditam, o efeito dos produtos a base de levedura no metabolismo de bactérias utilizadoras de ácido lático não é decorrente do fornecimento de ácidos caboxilícos, mas sim de um efeito direto da presença da S. cerevisiae no líquido ruminal. Da mesma forma, o aumento na população bacteriana ruminal se dá pela presença de células vivas da S. cerevisiae, mas não pelo fornecimento de ácido málico. Um grupo de pesquisadores incubou M. elsdenii na presença ou não de S. cerevisiae e demonstrou que a utilização de lactato pela bactéria foi aumentada quando na presença da levedura viva. No mesmo estudo, a suplementação com S. cerevisiae ao meio de cultivo bacteriano reduziu a disponibilidade de glicose para uso por Estreptococus bovis, assim como a produção de ácido lático pela bactéria. Esses efeitos foram obtidos com concentrações de 6 x 10⁷ células por mL de meio de cultivo. A dose típica recomendada para o uso em bovinos leiteiros é de 1 a 2 x 1010 unidades formadoras de colônia por dia para animais adultos. No caso de vacas leiteiras, assumindo um rúmen com cerca de 50 L de conteúdo, a concentração de S. cerevisiae seria de 2 a 4 x 105 células/mL, ou seja, aquém daquela que se mostrou efetiva in vitro em regular a disponibilidade de glicose para bactérias produtoras de ácido lático, e a produção e utilização de ácido lático. De qualquer maneira, a suplementação de vacas leiteiras com cepas vivas de S. cerevisiae foi capaz de aumentar o pH ruminal e de reduzir a incidência de vacas com pH ruminal < 5.8.

Em outro estudo utilizou-se vacas multíparas canuladas num delineamento casualisado tipo cruzado. As vacas foram suplementadas ou não com 1 x 1010 unidades formadoras de colônia de S. cerevisiae e alimentadas com uma dieta base contendo 60% de forragem (silagem de azevém) e 35% de fibra em detergente neutro (FDN) e cerca de 3 kg adicionais de concentrado contendo 21% de FDN. As vacas suplementadas com S. cerevisiae apresentaram um maior pH ruminal (Tabela 1).

Outros pesquisadores também observaram uma melhora no pH ruminal de vacas leiteiras expostas ao estresse calórico quando suplementadas com 2 x 1010 unidades formadoras de colônia de S. cerevisiae. A melhora no pH ruminal foi atribuída, em parte, a mudanças no comportamento alimentar dessas vacas (Tabela 2).

Redução na concentração de O₂ no rúmen

O ambiente do rúmen é, normalmente, considerado anaeróbio, apesar de existir pequenas quantidades de O₂ dissolvido no líquido ruminal. Normalmente, as concentrações de O₂ no líquido ruminal variam de 0,25 a a 1,0 µM. Em casos esporádicos, as concentrações podem chegar até 3 µM devido ao influxo de O₂ originário dos capilares no epitélio ruminal ou presente na saliva, água e alimentos consumidos. Essa presença constante de traços de O₂ em micro-ambientes no rúmen, principalmente próximo à parede e ao redor da fase sólida do conteúdo ruminal, parece explicar o porquê da maioria das células de leveduras estarem associadas à fração sólida do conteúdo ruminal, ao mesmo tempo que a concentração desses organismos é pequena na fase líquida.

Os microrganismos do rúmen são sensíveis à presença de O₂ e considerados estritamente anaeróbios. Essa sensitividade à presença de O₂ se dá em função da formação de espécies reativas de oxigênio, ou da sigla inglesa ROS (Reactive Oxygen Species), e da falta de enzimas capazes de detoxificar esses compostos. Bactérias anaeróbias têm pouca ou nenhuma atividade de catalase ou superóxido dismutase para neutralizar os peróxidos e os superóxidos anions. Com isso, a presença de O₂ no meio ruminal reduz o crescimento microbiano.

Com base nessa ideia, postulou-se que um dos mecanismos pelo qual o S. cerevisiae melhora a fermentação ruminal é por consumir O₂ e reduzir sua concentração no líquido ruminal. De acordo com pesquisadores, leveduras apresentam grande afinidade por O₂ e sua presença no rúmen estimula o crescimento microbiano de bactérias anaeróbias por remoção de maneira rápida e eficiente de parte do O₂ dissolvido. De acordo com os dados de um estudo, a presença de algumas cepas de S. cerevisiae na forma de células vivas aumentou o consumo de O₂ no líquido ruminal em 60 a 90% comparados com o grupo controle. O interessante é que o consumo de O₂ aumentou de 102 para 164 µM/minuto por litro de líquido ruminal com uso de uma cultura de levedura comercial, ou para até 189 µM/minuto por litro de líquido ruminal com uma cepa denominada NCYC 240. Nesse caso, a concentração de bactérias viáveis no líquido ruminal foi de 4,3 x 108/mL, cerca de 10 a 50 vezes menos que a concentração típica encontrada no rúmen. Mesmo ajustando o consumo de O₂ para a concentração de bactérias viáveis observadas no líquido ruminal, as diferenças seriam pequenas. O interessante é que dados da literatura mostram que o consumo de O₂ por misturas de microrganismos ruminais (bactérias + protozoários) geralmente é de aproximadamente 4.400 µM/minuto por litro de líquido ruminal, ou seja, mais de 40 vezes o valor obtido com o grupo controle no estudo citado anteriormente. Estudos com culturas puras de protozoários ruminais estimaram que o consumo de O₂ é aproximadamente 3 pM por célula por minuto no caso do gênero Isotricha. Já no caso de Dasytricha ruminantium, estimou-se que o consumo máximo de O₂, quando se manteve uma baixa concentração de O₂ no líquido ruminal, foi de 0,3 pM por célula por minuto. Assumindo estes valores para consumo de O₂ por protozoários ruminais (0,3 a 3 pM/célula/min), e concentrações de protozoários no conteúdo ruminal de 1 x 106/mL, a estimativa de consumo de O₂ por protozoários seria de  0,3 a 3 µM/min/mL de fluído ruminal. Portanto, os valores seriam de 300 a um máximo de 3,300 µM/min por litro de líquido ruminal.

Portanto, apesar dos autores terem encontrado um aumento marcante na concentração de bactérias totais e na de celulolíticas, é difícil postular que esse aumento se deu por redução na concentração de O₂ no líquido ruminal devido ao consumo proporcionado pelas cepas de S. cerevisiae. Primeiro, apesar de S. cerevisiae consumir O₂, a sua população total no rúmen seria pequena. No caso do estudo citado anteriormente, os pesquisadores utilizaram 200 mg de cultura de levedura contendo aproximadamente um total de 16,4 a 21,8 x 106 células incubados em 150 mL de líquido ruminal tamponado. Para uma vaca com 50 L de líquido ruminal, isso seria equivalente a 5 a 6 billiões de células no rúmen, o que equivale a 100 – 150 x103 células por mL de líquido ruminal, ou seja, uma concentração relativamente pequena quando comparada com aquela de bactérias e protozoários no rúmen. Dados de pesquisa indicam que a capacidade de leveduras em consumir O₂ depende da concentração de ácidos graxos voláteis no ambiente. Leveduras vivas são capazes de manter o consumo de O₂ com concentrações de ácidos graxos voláteis de até 40 mM, a partir da qual ele cai, até praticamente zero, quando a concentração de ácidos graxos chega a 110 mM, que é o valor comumente encontrado no fluído ruminal de vacas leiteiras. Como uma boa parte da população microbiana do rúmen é capaz de utilizar O₂, e leveduras estimulam o crescimento microbiano, é mais provável que um possível aumento no consumo de O₂ se dê por um efeito indireto. Ou seja, a inclusão de leveduras ativas no rúmen estimulariam o crescimento de populações capazes de metabolizar O₂. Um grupo de pesquisadores demonstrou que S. cerevisiae estimula o crescimento de protozoários Isotricha, que são capazes de consumir O₂.

É também provável que o aumento na concentração de bactérias celulolíticas no líquido ruminal se deva ao ambiente mais propício ao seu desevolvimento, com maior pH ruminal proporcionado pela ação da S. cerevisiae, que consome glicose, competindo, assim, com bactérias produtoras de ácido lático por substrato; e por estimular o desenvolvimento de bactérias consumidoras de ácido lático. Por outro lado, pesquisadores demonstraram que a adição de S. cerevisiae ao rúmen de carneiros reduziu o indicador de redução-oxidação (Redox) no líquido ruminal e minimizou a queda de pH do rúmen após o consumo de uma dieta rica em amido. O menor valor de Redox é um indicativo de menor concentração de O₂ no líquido ruminal.

Aumento na digestão de fibra

Um dos mecanismos de ação postulados para explicar o benefício das leveduras na produção de ruminantes é o aumento na digestão de carboidratos fibrosos no rúmen. Fungos agem de maneira sinergistica com bactérias ruminais no processo de digestão de carboidratos complexos presentes na parede celular de alimentos. As hifas de fungos têm a capacidade de penetrar a cutícula de plantas, o que reduz a resistência do tecido ao processo de digestão microbiana e cria pontos de adesão celular para bactérias. A adição de levedura viva estimula o crescimento de bactérias que digerem celulose e hemicelulose como Fibrobacter succinogens, Ruminococcus spp. e Butyrivibrio fibrosolvens, e aumentam a colonização da parede celular por fungos como o Neocallimastix frontalis. Um grupo de pesquisadores propôs que a adição de formas ativas de leveduras vivas melhora a colonização de partículas de alimentos, acelera o crescimento de bactérias celulolíticas, e estimula o crescimento das utilizadoras de lactato. Estas respostas, em nível de micro-ambiente ruminal, culminam com aumento na digestibilidade de fibra no rúmen, apesar de que a taxa de digestão parece não ser alterada. Esse aumento na digestibilidade da fibra no rúmen levaria a uma maior digestão de matéria orgânica em todo trato digestivo.

Em estudo com vacas leiteiras em meio de lactação no Brasil, demonstrou-se recentemente que a adição de levedura viva à uma dieta contendo 30% de FDN originário basicamente de silagem de milho, capim Tifton e polpa de laranja, aumentou a digestibilidade da FDN em todo trato digestivo. O interessante é que essa resposta não foi causada por mudanças no comportamento alimentar das vacas.

Aumento na síntese de proteína microbiana

De maneira geral, relatos de aumento na síntese de proteína microbiana mensurada in vivo são originários de relatos preliminares, e poucos são os estudos publicados em sua íntegra onde foi avaliado o impacto das leveduras no fluxo de nitrogênio (N) microbiano intestinal. Em recente meta-análise sobre o uso de S. cerevisiae na alimentação de ruminantes foi demonstrado que a digestibilidade aparente da matéria orgânica aumentou em média 0,8% em todo trato digestivo, supostamente devido a um aumento na digestibilidade ruminal. Uma das respostas observadas com o uso de leveduras na dieta de bovinos é o aumento na concentração de certas populações microbianas, principalmente dos grupos que digerem fibra e que consomem ácido lático. É esperado, portanto, que aumentos na digestibilidade ruminal da matéria orgânica, associados com um pequeno aumento na ingestão de matéria seca, resultem em maior concentração microbiana no líquido ruminal e maior fluxo de N microbiano.

Dados de pesquisa mostraram que a suplementação de dietas com S. cerevisiae aumentou o fluxo de proteína microbiana chegando ao duodeno em vacas leiteiras e em borregos. Por outro lado, um estudo mais detalhado não demonstrou mudanças no fluxo duodenal de proteína microbiana e de aminoácidos essenciais em vacas leiteiras suplementadas com S. cerevisiae quando alimentadas com dietas contendo 16.1 ou 18.8% de proteína bruta. Apesar da falta de efeito no fluxo de aminoácidos, a suplementação com levedura aumentou a produção de leite corrigido para 4% de gordura na dieta com valores mais baixos de proteína bruta.

Portanto, apesar das evidências do benefício do S. cerevisiae sobre a população microbiana ruminal, digestibilidade de fibra no rúmen, e de matéria orgânica em todo trato digestivo, ainda permanece obscuro se essas mudanças resultam em aumento no fluxo de proteína microbiana.

Mecanismos de ação pós-rúmen

Prevenção da adesão celular de patógenos intestinais

A parede celular da Sacharomyces cerevisiae apresenta camadas de glucanas e complexos de manose que são capazes de interagir com receptores celulares que influenciam respostas imunológicas.

Em bezerros, a diarreia é comumente causada por microganismos patogênicos, sendo um deles as bactérias. Estas podem aderir ao epitélio intestinal e invadir ou não as células do hospedeiro. Normalmente,  Salmonela spp. (S. dublin, S. newport, e S. typhimurium) e Escherichia coli são dois dos patógenos bacterianos mais comumente associados com diarreia. Em estudos in vitro, a maioria das Salmonelas spp se aderem à parede celular do S. cerevisiae, o que é sugerido como um mecanismo de prevenção de aderência e invasão das células intestinais. Um grupo de pesquisadores observou um efeito de proteção do S. cerevisiae contra S. typhimurium e Shiguella flexneri em roedores. Estudos no Brasil demonstraram a aderência de E. coli e S. typhimurium à parede celular de S. cerevisiae boulardii in vitro e in vivo em camundongos. Em células intestinais de suínos, o S. cerevisiae inibiu a expressão gênica para fator de necrose tumoral-α (TNF-α) induzido por E. coli enterotoxigênica. De maneira similar,  a fração solúvel do meio de cultivo do S. cerevisiae reduziu a abundância de RNAm para TNF-α e citocinas pró-inflamatórias em células intestinais tipicamente induzidas pela E. coli enterotoxigênica. Portanto, cultura de levedura contendo células vivas e mortas, fatores secretados pelo S. cerevisiae, e polissacarídeos presentes na parede celular seriam capazes de reduzir o risco de doença gastrointestinal por diminuir a aderência de patógenos ao epitélio intestinal, minimizar o processo inflamatório, e alterar a resposta imunológica com modulação na resposta imunológica inata.

Dados de pesquisa com bezerros mostraram que o uso de cultura de levedura nos primeiros 60 dias de vida reduziu o risco de diarreia, sendo esse efeito atribuído a uma possível redução no processo de adesão celular e colonização intestinal por patógenos devido ao uso de leveduras contendo oligossacarídeos de manose e glucana. Os autores sugeriram que os oligossacarídeos podem se ligar aos patógenos. Além disso, metabólitos produzidos durante o crescimento do S. cerevisiae são capazes de reduzir o crescimento bacteriano in vitro.

Respostas imunológicas

Boa parte da evidência do efeito dos produtos a base de leveduras sobre respostas imunológicas vem de sistemas in vitro. Entretanto, estudos in vivo também indicam efeitos sobre a resposta imune inata e celular. Supostamente, o mecanismo de ação de leveduras sobre as respostas imunológicas se dá pela ação de oligossacarídeos presentes na parede celular da S. cerevisiae que interage com células imunes presentes no trato digestivo. Acredita-se que esses efeitos sejam mediados pela ativação de macrófagos e células destruidoras naturais ou células NK da sigla inglesa “natural killer cells”.

Dados de um estudo mostram que macrófagos expostos a glucanas apresentaram aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias e ativação de sistemas de segundo mensageiro que ativam a resposta imunológica inata. De fato, oligossacarídeos componentes da parede celular de leveduras demonstraram melhorar a função de neutrófilos em humanos e em monogástricos.